Definizione: Una unità di assorbanza è definita come la quantità di acido nucleico che produrrà una lettura di uno, quando si misura un volume di un ml in una cuvetta di quarzo di un cm alla lunghezza d';onda di 260 nmm; infatti questo è derivato dall';equazione di Beer-Lambda.
A = ebc
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A è l';assorbanza (nessuna unità, poiché A = log10 P0 / P)
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e è l';assorbanza molare con unità di L mol-1 cm-1
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b è la lunghezza del percorso del campione, ovvero la lunghezza del percorso della cuvetta in cui è contenuto il campione. Esprimeremo questa misura in centimetri.
Biowave II
I coefficienti di estinzione individuali per ciascuna delle quattro basi del DNA sono:
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A = Assorbanza massima a 259nm, coefficiente di estinzione = 15,4 x 103 M-1 x cm-1 (pH 7,0).
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C = Assorbanza massima a 271nm, coefficiente di estinzione = 9.0x103 M-1 x cm-1 (pH 7.0).
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G = Assorbanza massima a 253 nm, coefficiente di estinzione = 13,7x103 M-1 x cm-1 (pH 7,0).
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T = Assorbanza massima a 267 nm, coefficiente di estinzione = 9.6x103 M-1 x cm-1 (pH 7.0).
Da questi valori possiamo osservare dove deriviamo il valore 10, che è il coefficiente di estinzione medio dei 4 nucleotidi.
Formula pratica: una formula molto semplice e utile per ottenere la molarità è la seguente:
# di nanomoli di un oligo = 1 / Ix10
Dove
I = lunghezza oligo
10 = il coefficiente di estinzione medio di tutti e 4 i nucleotidi
Esempio: quante micromole ci sono in 1 OD di un oligo 20mer?
# of? mols = 1 / 20x10 = 0,005 = 5nanomoli
Approssimazioni utili sul DNA:
* 1 A260 di SSDNA lungo = 37? G
* 1 A260 di oligo ss DNA = 33? Gs
* 1 A260 di oligo ssRNA = 33 ';g
* 1 A260 di dsDNA = 50? Gs
* 1 A260 di dsRNA = 40? Gs
Nota: l';effetto di estinzione sulla formazione del duplex, l';assorbanza non è l';aggiunta esatta dei singoli filamenti, piuttosto è circa 1,5 volte (non due volte come ci si aspetterebbe).
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